| | (خالــــی) سبد خرید
هنوز کالایی در سبد خرید شما ثبت نگردیده است .
جایگاه تبلیغاتی
همه چیز درباره الایزا

 

روش کار الایزا-کیت های الایزا-الایزا چیست-سنجش امین-کیتهای الایزا-نحوه تست الایزا-الایزا-ELISA -شیوه های الایزا -Sandwich ELISA  

ست الایزا را در حالت معمول برای ردیابی آنتی ژن یا آنتی بادی بكار می برند بدین ترتیب كه یكی از این دو ماده در بستر جامد ثابت می شود و برای ردیابی دومی بكار گرفته می شود، اما اساسا برای ردیابی هر جفت ماده ای كه مثل جفت آنتی ژن و آنتی بادی به هم گرایش داشته و قدرت اتصال مناسبی نسبت به هم دارند میتواند بكار گرفته شود (مثلا لكتین به لیگاند مربوطه اش یا مولكول به گیرنده اختصاصی اش) البته این پدیده یعنی اتصال بین دو ماده ای كه آنتی بادی و آنتی ژن نیستند اما گرایش به هم دارند اغلب اوقات مشكل آفرین است و برای بالا بردن حساسیت و اختصاصیت اتصال بین آنتی بادی و آنتی ژن در الایزا باید این اتصالات ناخواسته را به طریقی مهار كرده و یا كارهای جبرانی لازم را در نظر گرفت. 1 ) تست الیزا برای جستجوی آنتی ژن: ELISA روش بسیار حساسی است که (معمولا) برای جستجوی آنتی ژن یا آنتی بادی بکار میرود در تحت شرایط تنظیم شده (از نظر غلظت یونی و pH) پروتئین ها (آنتی ژن یا آنتی بادی) به طور خودبخود تمایل دارند که به بستر جامد (در این تست plate هایی از جنس پلی استیرن) متصل شوند، ماهیت این اتصال بخوبی معلوم نشده است اما برگشت پذیر بوده و با استفاده از pH های بالاتر یا پایین تر و استفاده از غلظت های یونی بالا اتصال قطع میشود این نوع اتصال خودبخودی اگر چه ظرفیت محدودی دارد ولی با بكارگیری سیستم های تقویتی مناسبی مثل سیستم آنزیم-سوبسترا این اتصالات وسیله بسیار خوبی برای طراحی سیستم الایزا گردیده است. برای انجام الایزا: 1 ) ابتدا باید پروتئین مورد نظر را به كف پلیت چسباند. 2 ) نقاط اتصال باقی مانده را باید با محلول پروتئینی مناسب مسدود كرد. 3 ) محلول مورد آزمایش را اضافه كرد تا دو ماده همدیگر را پیدا كرده و متصل شوند 4 ) سیستم های تقویتی اولیه را برای افزایش حساسیت آزمایش بكار گرفت 5 ) سیستم آنزیمی نهایی را به راه انداخته و رنگ نهایی تولید شده را اندازه گرفت حال این 5 مرحله به تفكیك توضیح داده می شوند: 1 ) اتصال پروتئین به كف پلیت (Coating): آنتی ژن (یا آنتی بادی) در مقادیری در حدود میکروگرم به داخل چاهک پلیت الایزا اضافه شده و فرصت داده میشود تا به مقدار کافی به کف چاهك (well) متصل شود برای اینكار بسته به نوع پروتئین بافرهای مختلفی به كار گرفته می شود و غلظت پروتئین نیز باید مناسب سازی شود در مقادیر بسیار پایین حساسیت ردیابی پایین می آید و در مقادیر بالای آنتی ژن اتصالات سستی نیز برقرار میشود كه در مراحل بعدی كنده شده و هنگام شستشو آنتی ژن همراه با آنتی بادی اختصاصی دفع می شوند و لذا حساسیت تست مجددا پایین می آید. بطور كلی این مرحله اساسی بوده و نقش زیادی در نتیجه نهایی دارد ایده آل های مورد انتظار برای این مرحله اینها هستند: الف) مقدار آنتی ژن متصل شده به كف همه چاهك های یك پلیت باید یكنواخت باشند و كمترین واریانس را در نتیجه ایجاد كنند، بدین معنی كه وقتی یك نمونه واحد را در چند چاهك مختلف منتقل نموده و آزمایش كنیم باید نتایج بدست آمده به هم نزدیك بوده و حداقل خطا را نشان دهند. همچنین اگر آزمایش مورد نظر در حجم بالا انجام میگیرد و چند پلیت را هم زمان كوت نموده و استفاده میكنیم باید جنس پلیت ها و شركت تهیه كننده آنها یكسان باشد تا از خطای مربوط به تفاوت در قدرت اتصال پلیت ها جلوگیری شود و ترجیحا بافر كوتینگ و زمان كوتینگ و محلول آنتی ژنی آماده شده برای كوتینگ بهتر است یكسان باشند. ب) اتصالات برقرار شده بین آنتی ژن و بستر جامد باید به اندازه كافی محكم و قوی باشند تا در مراحل شستشوی بعدی كنده نشوند، معمولا برای آنتی ژن های عادی، اتصال دهنده اضافی لازم نیست ولی اگر آنتی ژنی استثنائاً با روش معمول به كف پلیت نچسبید یا اتصالات سستی برقرار كرد از مواد و روش های خاصی برای اتصال آنتی ژن به كف بستر استفاده می شود (مثلاً استفاده از گلوتارآلدئید یا اشعه ایكس یا ...). ج) پروتئین متصل شده نباید آنقدر كم باشد كه نتواند مقادیر بالای آنتی بادی را جذب كند در این صورت غلظت های بالای آنتی بادی قابل تشخیص نخواهد بود از طرفی پروتئین متصل شده نباید آنقدر زیاد باشد كه اتصالات غیراختصاصی از اتصالات اختصاصی بیشتر شوند كه در این صورت جواب آزمایش قابل اغتماد نخواهد بود برای تامین این سه هدف تمهیدات خاصی به كار گرفته می شوند كه در فرصتی مناسب توضیح داده خواهند شد 2 ) مرحله مسدود سازی یا بلوكینگ (blocking): نقاطی از كف پلیت كه با پروتئین اختصاصی پوشانده نشده اند با استفاده از محلول های پروتئینی خنثی (از این نظر كه در واكنش اختصاصی بعدی اثر سوئی ندارد) پوشانده می شوند محلول های پروتئینی برای این منظور حاوی شیر کم چربی یا آلبومین گاوی یا ژلاتین و یا کازئین میباشند. علاوه بر پروتئین از دترژانت های غیر یونی خاصی نظیر Tween 20 یا Tween 80 یا ... نیز به عنوان كمكی استفاده می شوند نوع این مواد و مقادیر بكار برده شده به صورت تجربی تعیین می شوند و با توجه به تجربیات دیگران می توان محدوده خاصی را برای كار مورد نظر امتحان كرد و بهترین غلظت را بدست آورد (چون پروتئین ها از ریشه های جانبی متفاوتی برخوردارند لذا برای پروتئین های بسیار خالص مثل پروتئین های ریكامبینانت مناسب سازی این تركیبات در بالا بردن اعتبار نتایج بسیار كمك كننده خواهد بود). علاوه بر پروتئین و دترژانت، غلظت یونی بافر بلوك كننده نیز اهمیت زیادی دارد و برای اتصال انتخابی پروتئین مورد نظر (از میان مخلوط پروتئینی) میتوان بافرهای مختلف و غلظت یونی متفاوت را ارزیابی كرده و بهترین بافر را برای آزمایش مورد نظر بدست آورد. 3 ) اتصال آنتی ژن و آنتی بادی محلول مورد آزمایش كه احتمال میرود حاوی مقادیر قابل ردیابی از آنتی بادی بر علیه آنتی ژن اختصاصی موجود در كف پلیت میباشد در این مرحله در بافر مناسبی تهیه شده و اضافه می شود آنتی بادی شناور در محلول، آنتی ژن متصل به بستر را پیدا كرده و به آن متصل می شود بندرت این آنتی بادی متصل به آنزیم است اما در اغلب اوقات كونژوگه آنزیمدار در مرحله بعدی بكار گرفته می شود. آنتی بادی های متصل نشده با عمل شستشو از محیط حذف می شوند بافر شستشو معمولا دارای پروتئین خنثی به كار گرفته شده در محلول بلوكان است. چرا؟ حاوی دترژانت میباشد. چرا؟ و از نظر قدرت و pH بافری مناسب برای اتصال آنتی ژن با آنتی بادی است. آنتی بادی ها، سرم ، و محلولهای بكار گرفته شده در مراحل مختلف الایزا معمولا در بافر شستشو رقیق می شوند. 4 ) سیستم های تقویتی اولیه سیستم تقویتی اولیه قبل از سیستم تقویتی اصلی (كه همانا بكار گرفتن خصوصیت آنزیمهاست) میباشد در این مرحله ما واكنش های اضافه تری را به كار میگیریم تا قدرت اندازه گیری تست (حساسیت و اختصاصیت) بالا برده شود. بدین منظور از قدرت تقویت كنندگی بیوتین-آویدین، بیوتین-استرپتاویدین، لكتین-لیگاند و ... استفاده می شود. 5 ) تقویت آنزیمی هر آنزیمی بر روی سوبسترای اختصاصی خود اثر كرده و آنرا به محصول تبدیل می كند این واكنش در طی زمان منجر به جمع شدن مقدار متنابهی از محصول در محیط می شود بدین معنی كه با گذشت زمان معینی یك مولكول آنزیم می تواند مولكول های سوبسترای بسیاری را به محصول تبدیل كند این اثر افزایشی در حقیقت اساس الایزا را تشكیل میدهد. بدین ترتیب كه آنتی بادی نهایی باقی مانده پس از شستشوی نهایی با مولكول آنزیم متصل است و افزودن سوبسترا در طی زمان معینی (مثلاً یك ساعت) منجر به آزاد سازی مقادیر متنابهی سوبسترا می گردد كه یا خود رنگی میباشد یا در واكنش با ماده دیگری (كروموژن یا رنگزا) كه به محیط اضافه شده است رنگ تولید میكند در نهایت رنگ تولید شده توسط دستگاه قرائت كننده مخصوصی خوانده شده و محاسبات لازم بر روی داده های بدست آمده انجام می گیرد اساس تست Sandwich ELISA برای اندازه گیری سیتوکین در روش الایزای ساندویچی مولكول اندازه گیری شده در واقع در بین دو مولكول مختلف آنتی بادی قرار میگیرد (ساندویچ میشود) مثلا این روش را در مورد اندازه گیری سایتوكاین اینترفرون گاما شرح میدهیم: اساس) سلول های طحالی گرفته شده از موش های دریافت کننده واکسن در اثر تحریک با آنتی ژن اختصاصی در محیط کشت تکثیر پیدا خواهند کرد برای تعیین اینکه غالب سلول های تکثیر یابنده از نوع Th1 هستند یا Th2 باید پروفیل سیتوکینی در محیط کشت مشخص شود بدین منظور تعیین مقدار سیتوکین های IL-4 و IFN-g ترشح شده توسط سلول ها در محیط کشت مد نظر قرار میگیرد. چنانكه در شكل زیر مشخص شده است در این روش آنتی بادی منوکلونال ضد آنتی ژن به کف plate چسبانده میشود سپس فرصت داده میشود تا آنتی ژن (در این تحقیق سیتوکین IL-4 و IFN-g ) به آن متصل شود در مرحله بعدی آنتی بادی پلی کلونال ضد آنتی ژن اضافه میشود که متصل به آنزیم پراكسیداز HRP است و اضافه شدن سوبسترا همراه با کروموژن منجر به ایجاد محصول رنگی میشود که توسط دستگاه ELISA Reader قرائت میگردد چون در این روش آنتی ژن در بین دو آنتی بادی قرار میگیرد لذا به ساندویچ مشهور شده است.

                                                                                                                                                             : اساس و انواع روشهای الایزا

اساس واکنش:

الایزای غیر مستقیم :

برای تعیین آنتی بادی اختصاصی و یا تیتراسیون آنتی بادی در نمونه های سرمی استفاده می شود.

در واکنش این سیستم آنتی ژن به جدار چاهک ها (از جنس پلی استیرن) متصل شده (کوت می شود). سپس نمونه حاوی آنتی بادی به چاهک ها اضافه می شود. پس از افزودن نمونه و طی زمان انکوباسیون شستشو انجام شده و سپس آنتی هیومن گلوبولین نشاندار شده با آنزیم به چاهک اضافه می شود. (بر حسب اینکه چه کلاسی از آنتی بادی برای اندازه گیری اهمیت دارد نوع آنتی هیومن مورد استفاده نیز متفاوت است مثلأ برای IgG از آنتی هیومن IgG استفاده می شود).

اختصاصیت روش بستگی به آنتی ژن کوت شده در چاهک ها دارد.

برای جلوگیری از جذب غیر اختصاصی پروتئین های موجود در سرم و جلوگیری از اشغال نقاط اتصال آنتی ژن نمونه بوسیله بافر رقیق کننده نمونه (Sample Diluent) رقیق شود.

الایزای ساندویچ:

این روش خود به دو دسته تقسیم می شود

الف) روش Ag Capture یا Ab Sandwich

شایعترین روش الایزا بوده و یک آنتی ژن (که باید دو ناحیه آنتی ژنیک متفاوت داشته باشد مثل TSH, LH, FSH, PSA و hCG) بین دو آنتی بادی اختصاصی قرار می گیرد. یک آنتی بادی برای به دام انداختن آنتی ژن به چاهک کوت می شود و آنتی بادی دوم که با آنزیم نشاندار شده است به عنوان شناساگر عمل می کند

ب) روش Antibody Capture

این روش خود به دو دسته تقسیم می شود:

1) روش Direct Ab Capture یا Ag Sandwich

در این روش از آنتی ژن کوت شده برای به دام انداختن یک آنتی بادی اختصاصی استفاده می شود. سپس آنتی ژن نشاندار به آنزیم به محیط اضافه شده و از طریق بازوی دیگر آنتی بادی (Fab) به آن متصل می شود. در نتیجه آنتی بادی اختصاصی در .(HBs Ab) بین دو آنتی ژن ساندویچ می شود مثل کیت

2) روش Indirect Ab Capture یا Indirect Ag Sandwich

آنتی هیومن گلوبولین به چاهک کوت شده و با اضافه کردن نمونه آنتی بادی به دام می افتد و سپس با اضافه کردن آنتی ژن اختصاصی به محیط یک کمپلکس ایمنی تشکیل می شود. سپس آنتی بادی اختصاصی نشاندار بر علیه آنتی ژن به عنوان سیستم شناساگر استفاده می شود.

الایزای رقابتی یا مهاری:

در روش های فوق اساس سنجش بر رقابت بین دو آنتی بادی یا دو آنتی ژن (که یکی نشاندار است) است.

روش رقابتی: هر دو آنالیت نشاندار و غیر نشاندار با هم به سیستم اضافه می شود.

روش مهاری یا بلاکینگ: ابتدا آنالیت اضافه شده و پس از یک دوره انکوباسیون آنالیت نشاندار اضافه می گردد.

الف) الایزای رقابتی یا مهاری برای آنتی ژن:

آنتی ژن نشاندار و آنتی ژن موجود در نمونه برای اتصال به یک آنتی بادی اختصاصی کوت شده در چاهک با هم رقابت کرده. منحنی این روش به صورت معکوس است، بدین معنی که آنالیت نشاندار در حضور مقادیر زیاد آنالیت غیرنشاندار موجود در نمونه کمتر به آنتی بادی متصل می شود. روش کمی لومینسانس استفاده می شود.

ب) الایزای رقابتی یا مهاری برای آنتی ژن:

آنتی بادی نشاندار و آنتی بادی موجود در نمونه برای اتصال به یک آنتی ژن کوت شده در چاهک با هم رقابت کرده. منحنی این روش به صورت معکوس است، بدین معنی که آنالیت نشاندار در حضور مقادیر زیاد آنالیت غیرنشاندار موجود در نمونه کمتر به آنتی می باشد HBc Ab بادی متصل می شود. شاخصترین مثال برای این روش تست  

  مراحل يك آزمون الايزا

مراحل انجام يك آزمون الايزا به‌صورت زير مي‌باشد

1)     جذب يك آنتي‌ژن يا آنتي‌بادي به سطوح جامد پلاستيكي كه اصطلاحا پوشش‌دهي ناميده مي‌شود

2)     افزودن نمونه‌هاي مورد آزمايش

3)     انكوباسيون واكنشگرها براي دراختياز قراردادن مدت زمان كافي براي انجام واكنش

4)     جدا نمودن واكنشگرهاي متصل شده و واكنش داده از واكنشگرهاي آزاد و متصل نشده با استفاده از عمل شستشو

5)     افزودن عوامل متصل شده با آنزيم

6)     انكوباسيون واكنشگرها براي دراختيار قراردادن مدت زمان كافي براي انجام واكنش

7)     جدا نمودن واكنشگرهاي متصل شده و واكنش داده از واكنشگرهاي آزاد و متصل نشده با استفاده عمل شستشو

8)     افزودن سوبستراي آنزيم جهت تشخيص واكنش دهنده‌ها

9)     انكوباسيون واكنشگرها براي دراختيار قراردادن مدت زمان كافي براي انجام واكنش

10) خاتمه دادن واكنش آنزيمي توسط متوقف كننده‌ها و قرائت دانسيتة نوري بدست آمده توسط دستگاه اسپكتروفتومتر

 

 

 

شرح مراحل فوق در ادامه آمده است: 

  فاز جامد

امروزه بيشتر از پليت‌هاي 96 خانه‌اي بعنوان فاز جامد استفاده مي‌شود. انواع انعطاف‌پذير و جداشدني از پلي‌وينيل كرايد و انواع سخت و محكم از پلي‌استيرن ساخته مي‌شوند. هم ‌اكنون شركت‌هاي معتبر و متعددي به‌ساخت انواع مختلف پليت‌هاي الايزا مشغول هستند دربعضي از انواع اين پليت‌ها، كف چاهك‌ها صاف و تخت بوده و بعضي ديگر مقعر مي‌باشند.

 بعضي از پليت‌ها داراي خاصيت چسبندگي بالا بوده و بعضي داراي چسبندگي متوسط مي‌باشند. امروزه آزمايشهاي متعددي با موفقيت با هر كدام از اين نوع پليت‌ها انجام مي‌شود و نمي‌توان گفت كه قطعا كدام نوع پليت برتري بر ديگر انواع پليت‌ها دارد. مي‌توان با انجام دو آزمايش الايزاي كاملا يكسان كه تنها در نوع پليت متفاوتند و بررسي نتايج تشخيص داد كه براي كدام نوع از آنتي‌ژن، كدام پليت بهتر است. بطور كلي پليت‌هايي كه انتهاي چاهك‌هاي آنها تخت مي‌باشد توصيه مي‌شود.

 پوشش‌دهي

اين مرحله كه يكي از مهمترين مراحل آزمون الايزا مي‌باشد عبارتست از اتصال پروتئين آنتي‌ژن يا آنتي‌بادي بر  روي پليت       ,درون چاهك‌ هاي يك پليت 96 خانه‌اي, كه عمدتا براساس واكنش‌ هاي آبگريز مابين ماتريكس پلاستيكي و پروتئين مي‌باشد.  بنابراين هر پروتئين يك ثابت اتصال متفاوتي با پليت‌ها دارد. اين واكنش بستگي به  بار خالص پروتئين ندارد.

 بنابراين افزودن هيدروفوبيسيتة واكنش پروتئين پليت موجب بروز اين نواحي  هيدروفوب در پروتئين‌ها شده و واكنش مابين پليت و پروتئين را مستحكم‌ تر مي‌ نمايد، اين دناتوره نمودن جزيي  پروتئين‌ها توسط قراردادن پروتئين در معرض دترژنت‌هاي ملايم و مواد داراي pH پائين حاصل مي‌شود كه بعد از اين مجاورت مي‌توان با استفاده از يك روش دياليز مناسب، بافر پوشش‌دهي را با اين مواد دناتوره كننده تعويض نمود.

 عمل پوشش‌دهي به عوامل زير بستگي دارد.

الف) مدت زمان پوشش‌دهي

ب) دما

ج) غلظت پروتئين‌هايي كه بايد پوشش داده شوند.

د)‌ نسبت سطح چاهك‌ها به حجم محلول پوشش دهي

هـ) ضريب انتشار مولكولهاي پروتئيني درون محلول پوشش‌دهي درون چاهك‌ها

عوامل فوق يكپارچه بوده و جداي از يكديگر نيستند. يكي از مهمترين موارد بدست آوردن غلظت مناسب از پروتئين براي اتصال مناسب به پليت مي‌باشد كه از طريق تيتراسيون پروتئين بدست مي‌آيد.

محدودة 1 تا 10 μg/ml در حجم 50μl يك راهنمايي خوبي براي بدست آوردن غلظت مناسب اغلب پروتئين‌ها جهت اتصال خوب به پليت مي‌باشد البته اين محدوده وابستگي به خلوص نسبي پروتئين موردنظر جهت پوشش‌دهي دارد بنابراين غلظت يك پروتئين جهت پوشش‌دهي وابسته به فعاليت آن پروتئين مي‌باشد مشخص است كه يك محلول پروتئيني كه داراي مقدار كمي از پروتئين موردنظر باشد مقدار اتصال آن پروتئين به پليت برطبق نسبت حضور آن پروتئين در محلول كم مي‌باشد و ناخالصي‌هاي موجود در محلول پروتئيني سطوحي را كه بايد پروتئين موردنظر ما در اختيار داشته باشد اشغال مي‌نمايند كه در نهايت منجر به يك اندازه‌گيري ضعيف مي‌شود.

 با استفاده از چند تست الايزا كه در آنها غلظت پروتئين موردنظر براي پوشش‌دهي متفاوت است مي‌توان به يك غلظت مناسب از پروتئين جهت پوشش دادن دست يافت. توجه به اين مطلب مهم است كه دانسيتة اتصال پروتئين به پليت درنتيجة نهايي بسيار مهم است. اتصال با دانسيتة بالا حتي ممكن اسب برخلاف انتظار ما به نتايج ضعيف منجر شود چرا كه اين دانسيتة بالا مي‌تواند از لحاظ قضايي اجازة نزديك شدن پروتئين دوم (آنتي‌ژن يا آنتي‌بادي) را به پروتئين پوشش داده شده ندهد. درحقيقت مولكولهاي پروتئين پوشش داده شده آنقدر باشدت و استحكام بالايي (و بينابين يكديگر) به سطح چاهك متصل شده‌اند كه حتي جايگاه‌هاي اتصالشان در دسترس اتصال به پروتئين دوم (فرضا آنتي‌بادي) نمي‌باشد.

 

 غلظت‌هاي بالاي پروتئيني كه بايد پوشش داده شود نيز منجر به‌همين مسئله مي‌شود.  رابطه غلظت يك آنتي‌ژن يا  آنتي‌بادي با چگالي نوري (OD) بدست آمده در مرحلة نهايي تست الايزا يك رابطة خطي صرف نمي‌باشد و براي هر پروتئيني بسته به فرم فضايي آن پروتئين و نيز در هر محدوده‌اي از غلظت‌هاي مختلف آن پروتئين متفاوت مي‌باشد.

ميزان هيدروفوبيسيتة واكنش پروتئين پليت وابسته به دما نيز مي‌باشد افزايش دما موجب افزايش اين  هيدروفوبيسته مي‌شود  و دانستيم كه اين افزايش منجر به اتصال مستحكم‌ تر پروتئين به پليت مي‌ شود يكي از   رايج‌ترين روش‌هاي پوشش‌دهي از لحاظ دما، در مجاورت قراردادن پليت با پروتئين در دماي 37°c مي‌ باشد  كه در اين دما بين 1 تا 3 ساعت زمان مناسبي براي اغلب پروتئين‌  ها مي‌باشد در مرتبة بعد مي‌توان روش  پوشش‌دهي در طول شب در 4°c و يا تركيبي از ايندو را بكار گرفت.  

بسته به ماهيت پروتئين‌ها، گاهي اوقات پوشش‌دهي در دماي آزمايشگاه با مدت زمان طولاني‌تر موردنظر قرار مي‌گيرد.

البته مشخص است كه افزايش دما در مدت زمان طولاني ممكن است باعث تغييراتي در ساختار پروتئين موردنظر جهت اتصال به پليت شود. تكان دادن يكنواخت، آرام و منظم پليت نيز مي‌تواند با افزايش ميزان برخورد و درنتيجه اتصال پروتئين به پليت، زمان موردنظر براي پوشش‌دهي را كاهش دهد.

  بافر پوشش‌دهي

بيشترين بافرهايي كه هم‌اكنون مورد استفاده قرار مي‌گيرند عبارتند از :

·         بافر كربنات 6/9 = pH با كربنات 50  ميلی مولار،

  •  Tris – Hcl   بيست ميلی مولار با pH = 8/5 و يا
  •  PBS   10 ميلی مولار با pH = 7/2

. اغلب روش‌هاي الايزا از يكي از اين سه نوع بافر استفاده مي‌نمايند

 بافرهايي غير از موارد فوق هنگامي مورد استفاده قرار مي‌گيرند كه مشكلي در پوشش‌دهي با بافرهاي فوق بوجود آمده باشد. از لحاظ تئوري بهترين بافري كه مورد  استفاده قرار مي‌ گيرد بافري است كه داراي pH برابر با 1 تا 2 واحد بالاتر از (PI) پروتئين اتصالي باشد. اما درعمل اندازه‌گيري اين مطلب آسان نمي‌باشد چراكه پروتئين اتصالي (فرضا آنتي‌ژن) حاوي مخلوطي از پپتيدهاي متفاوت مي‌باشد. با انجام چند آزمايش الايزا كه pH‌هاي متفاوت و قدرت يوني متفاوتي در بافر پوشش‌دهي داشته باشد مي‌توانيم اتصال بهتر و مناسب‌تر پروتئين به پليت را بدست آوريم.

پروتئين‌ هاي با خاصيت اسيدي، احتياج به يك pH پائين‌ تر جهت خنثي نمودن نيروي دافعه مابين پروتئين و پليت دارند و در آزمايشي جهت پوشش دادن پروتئين‌ هاي ويروس Herpes simplex كه خاصيت اسيدي دارند بهترين pH در محدودة 5/2 تا 6/4 بدست آمده است.

يا كربنات اغلب موفقيت‌آميز  است .PBS در روش‌ هاي رايج امروزي پوشش دادن با بافر

گاهي اوقات بعضي از آنتي‌ژن‌ها مشكلاتي را در پوشش‌دهي بوجود مي‌آورند اين آنتي‌ژن‌ها شامل پلي‌ساكاريدها ليپوپلي‌ساكاريدها و گليكوليپيدها هستند كه پوشش‌دهي مستقيم را منجر به نتايج ضعيف و نامناسب مي‌نمايند در اينگونه موارد يك پوشش‌دهي ابتدايي موردنياز است كه با يك آنتي‌سرم اختصاصي انجام مي‌شود كه يك حالت ساندويچي را بوجود مي‌آورد كه در ادامة همين فصل توضيح داده خواهد شد.

بنابراين مخلوط تخليص نشده آنتي‌ژن‌ها مناسب براي پوشش‌دهي مستقيم نمي‌باشد و درصورت نياز از الايزاي ساندويچي استفاده مي‌شود.

بدليل ماهيت غير كووالانسي اتصالي پروتئين به پليت، جداشدن يك پروتئين از پليت نيز ممكن است رخ دهد اما اگر شرايط پايدار و استاندارد باشد اين مطلب تأثير مهمي در يك آزمون الايزا نخواهد گذاشت.